Verordnung der Oö. Landesregierung vom 15. September 1997 zur Bekämpfung der bakteriellen Ringfäule der Kartoffel

Text

Nr. 125

Verordnung

der Oö. Landesregierung vom 15. September 1997 zur Bekämpfung der

bakteriellen Ringfäule der Kartoffel

Auf Grund des § 16 des O.ö. Kulturpflanzenschutzgesetzes, LGBl. Nr. 37/1951, in der Fassung des Landesgesetzes LGBl. Nr. 10/1955 wird verordnet:

§ 1 Zweck

Diese Verordnung regelt die im Zusammenhang mit dem Auftreten der bakteriellen Ringfäule der Kartoffel (Erreger: Clavibacter michiganensis [Smith] Davis et al. ssp. sepedonicus [Spieckermann et Kotthoff] Davis et al., nachfolgend Schadorganismus genannt) gebotenen Maßnahmen. Die Maßnahmen betreffen

(1) Die Landwirtschaftskammer für Oberösterreich als Pflanzenschutzstelle (§ 7 Abs. 1 des O.ö. Kulturpflanzenschutzgesetzes) hat systematische Erhebungen über das Auftreten des Schadorganismus an Kartoffelknollen und erforderlichenfalls Kartoffelpflanzen (Solarrum tuberosum L.) durchzuführen.

(2) Im Fall von Kartoffelknollen werden für diese Erhebungen Proben von Pflanzkartoffeln und anderen Kartoffeln, vorzugsweise aus eingelagerten Partien, entnommen und nach dem Verfahren des Anhangs I amtlichen Laboruntersuchungen zur Feststellung und Diagnose des Schalorganismus unterzogen. Zusätzlich kann gegebenenfalls eine amtliche Beschau nach Durchschneiden von Knollen aus anderen Proben vorgenommen werden.

(3) Im Fall von Kartoffelpflanzen werden diese Erhebungen nach geeigneten Verfahren durchgeführt und die Proben amtlichen Laboruntersuchungen unterzogen.

(4) Anzahl, Herkunft und Zusammensetzung der Proben und der Entnahmezeitpunkt werden von der Landwirtschaftskammer für Oberösterreich im Sinne der Richtlinie 77/93/EWG nach anerkannten wissenschaftlichen und statistischen Grundsätzen und nach Maßgabe der Biologie des Schalorganismus sowie unter Berücksichtigung der Kartoffelerzeugungssysteme des Landes festgelegt.

(5) Die Landesregierung ist mindestens einmal jährlich bis zum 31. März des Folgejahres über die Ergebnisse der im Abs. 1 genannten Erhebungen einschließlich der Einzelheiten der Beprobung gemäß Abs. 4 zu unterrichten.

§ 3 Anzeigepflicht

Das Auftreten und jeglicher Verdacht des Auftretens des Schadorganismus an Kartoffelpflanzen oder Kartoffelknollen ist vom Inhaber (Eigentümer, Fruchtnießer, Pächter, sonstiger Inhaber) unverzüglich der Bezirksverwaltungsbehörde anzuzeigen.

§ 4

Maßnahmen bei Verdacht des Auftrefens

(1) Bei Verdacht des Auftretens des Schadorganismus hat die Behörde amtliche Laboruntersuchungen nach den Verfahren der Anhänge I und II Z. 1 zu veranlassen. Bei Bestätigung gelten die Vorschriften gemäß Anhang II Z. 2.

(2) Werden bei einer Untersuchung gemäß Abs. 1 verdächtige sichtbare Symptome der Krankheit diagnostiziert oder ist ein Immunfluoreszenztest gemäß Anhang I oder ein anderer geeigneter Test positiv ausgefallen, hat die Behörde bis zur Abklärung des Verdachts

(1) Für den Fall, daß Knollen oder Pflanzen gemäß § 5 Z. 1 für kontaminiert erklärt worden sind, hat die Behörde zu veranlassen, daß der Kartoffelbestand, der mit dem befallenen Bestand klonal verbunden ist, gemäß § 4 Abs. 1 untersucht wird. Die Untersuchungen werden vorzugsweise nach Risikograd vorgenommen und erfassen so viele Knollen oder Pflanzen, wie nötig sind, um den wahrscheinlichen Ausgangspunkt und das Ausmaß der wahrscheinlichen Kontamination festzustellen.

(2) Je nach Untersuchungsergebnis hat die Behörde gemäß § 5 Z. 1, 2 und 3 gegebenenfalls eine weitere Kontaminationserklärung vorzunehmen, das Ausmaß der wahrscheinlichen Kontamination neu zu bestimmen und die Sicherheitszone neu abzugrenzen.

§ 7 Schutzmaßnahmen

(1) Knollen oder Pflanzen, die gemäß § 5 Z. 1 für kontaminiert erklärt worden sind, dürfen nicht angebaut werden und sind unter Kontrolle der Landwirtschaftskammer für Oberösterreich als Pflanzenschutzstelle

(2) Knollen oder Pflanzen, die gemäß § 5 Z. 2 für wahrscheinlich kontaminiert erklärt worden sind, dürfen nicht angebaut werden und sind unbeschadet der Ergebnisse der im § 6 genannten Untersuchung von klonal verbundenen Beständen unter Kontrolle der Landwirtschaftskammer für Oberösterreich als Pflanzenschutzstelle einer geeigneten Verwendung oder Behandlung gemäß Anhang IV Z. 2 zuzuführen, sofern nachweislich keine Gefahr einer Verschleppung des Schadorganismus besteht.

(3) Geräte, Fahrzeuge, Schiffe, Lagerräume oder Teile davon und alle anderen Gegenstände einschließlich Verpackungsmaterial, die gemäß § 5 Z. 1 für kontaminiert oder gemäß Z. 2 für wahrscheinlich kontaminiert erklärt worden sind, sind entweder zu vernichten oder nach geeigneten Verfahren gemäß Anhang IV Z. 3 zu reinigen und zu desinfizieren. Nach der Desinfizierung gelten diese Gegenstände als nicht mehr kontaminiert.

(4) Unbeschadet der in Abs. 1 bis 3 genannten Maßnahmen gilt für die Sicherheitszone (§ 5 Z. 3) das Maßnahmenpaket gemäß Anhang IV Z. 4.

(5) Wenn Personen die in Abs. 1 bis 4 enthaltenen Vorschriften außer acht lassen, hat die Bezirksverwaltungsbehörde die zur umgehenden Herstellung des den Vorschriften entsprechenden Zustandes erforderlichen Vorkehrungen dem Verpflichteten durch Bescheid aufzutragen oder bei Gefahr im Verzug unmittelbar anzuordnen und nötigenfalls gegen Ersatz der Kosten durch den Verpflichteten durchführen zu lassen.

§ 8 Zuständigkeit; amtliche Laboruntersuchungen

(1) Behörde im Sinne dieser Verordnung ist die Bezirksverwaltungsbehörde. Erstreckt sich eine Maßnahme über den Bereich eines Verwaltungsbezirkes hinaus, ist dies die Landesregierung.

(2) Eine Laboruntersuchung gilt als amtlich, wenn sie von hiezu befähigten Anstalten des Bundes oder der Länder durchgeführt wurde.

§ 9 Ausnahmen

(1) Die Landesregierung kann für wissenschaftliche Untersuchungen und Versuche sowie Züchtungsvorhaben Ausnahmen von den in §§ 6 und 7 Abs. 1 bis 4 dieser Verordnung genannten Maßnahmen - erforderlichenfalls unter entsprechenden Auflagen - zulassen, soweit hiedurch die Bekämpfung des Schadorganismus nicht beeinträchtigt wird und keine Gefahr seiner Verschleppung entsteht.

(2) Die Landesregierung hat die Einhaltung eines Bescheides nach Abs. 1 einschließlich darin vorgeschriebener Auflagen mindestens einmal jährlich zu überprüfen.

§ 10

Züchtungs-, Haltungs- und Manipulationsverbot Das Züchten und Halten des Schadorganismus sowie das Arbeiten mit diesem ist unbeschadet des § 15 Abs. 2 und 3 des O.ö. Kulturpflanzenschutzgesetzes verboten.

§ 11

Berichte der Landesregierung

(1) Die Landesregierung übermittelt dem Bundesminister für Land- und Forstwirtschaft einmal jährlich - bis zum 30. April des Jahres hinsichtlich des vorangegangenen Jahres

(2) Die Landesregierung unterrichtet den Bundesminister für Land- und Forstwirtschaft unverzüglich über

(1) Diese Verordnung tritt nach Ablauf des Tages ihrer Kundmachung im Landesgesetzblatt für Oberösterreich in Kraft.

(2) Durch diese Verordnung wird die Richtlinie 93/85/EWG des Rates vom 4. Oktober 1993 zur Bekämpfung der bakteriellen Ringfäule der Kartoffel (ABl.Nr. L 259 vom 18.10.1993, S. 1) umgesetzt. Anhänge I-IV

Anhang I

VERFAHREN ZUR ERMITTLUNG UND IDENTIFIZIERUNG DES RINGFÄULEBAKTERIUMS

CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL. SSP. SEPEDONICUS

(SPIEKERMANN ET KOTTHOFF) DAVIS ET AL . IN EINHEITEN VON

KARTOFFELKNOLLEN

Entnahme von Gewebeproben am Nabelende

1.1 200 Knollen unter fließendem Leitungswasser waschen; sodann mit einem ordnungsgemäß desinfizierten Skalpell oder Kartoffelschäler die Epidermis um das Nabelende jeder Knolle entfernen; die Desinfektion kann durch Eintauchen des Kartoffelschälers in 70%iges Äthanol und durch Abflammen erfolgen.

1.2 Mit einem Messer oder einem Kartoffschäler sorgfältig kegelförmige Gewebestücke aus den Nabelenden herausschneiden. Dabei ist darauf zu achten, daß vor allem vaskuläres Gewebe erfaßt wird. Die Nabelenden sollten, sobald sie entfernt sind, innerhalb von 24 Stunden verarbeitet (Abschnitt 3) oder höchstens 2 Wochen lang bei - 20 °C aufbewahrt werden.

3.1 Die Nabelenden werden unterhalb 30 °C gerade bis zur vollständigen Mazerierung homogenisiert. Die Mazeration kann mit Hilfe eines für Corynebacterium sepedonicum

Seile 507

nichttoxischen Verdünnungsmittels erzielt werden (z.B. 0,05 M phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) pH 7,0); die Zugabe eines nichttoxischen Verflüssigungsmittels ist anzuraten, und es kann sich als notwendig erweisen, ein nichttoxisches Schaumverhütungsmittel zu verwenden (Anlagen 1 und 2).

Eine zu starke Mazeration sollte vermieden werden.

3.2 Die Bakterien werden durch eines der folgenden Verfahren (1) aus dem Homogenat extrahiert:

A a) Bei höchstens 180 g 10 Minuten lang zentrifugieren.

3.3 Das Pellet in sterilem 0,01 M Phosphatpuffer pH 7,2 (Anlage 2) suspendieren, so daß ein Gesamtvolumen von etwa 1 ml erreicht wird. In zwei gleiche Teile teilen und einen Teil nach Einfrieren auf -20 °C (Z) oder nach Gefriertrocknung zu Referenzzwecken aufbewahren. Den anderen Teil in zwei Hälften teilen, deren eine für den IF-Test und die Gram-Färbung und deren andere für den Eierfruchttest verwendet wird.

3.4 Alle positiven C.-sepedonicum-Kontrollen und -proben müssen unbedingt getrennt behandelt werden, damit eine Kontamination vermieden wird. Dies gilt für IF-Objektträger und Eierfruchttests.

Gram-Färbung

4.1 Gram-Färbetests für alle Pellet-Verdünnungen (Abschnitt 5.2.1) sowie für alle aufgeschnittenen Knollen (Abschnitt 2), die Glasigkeit, Fäulnis oder andere verdächtige Symptome aufweisen, zubereiten. Die Proben sollten vom Rande der erkrankten Gewebe genommen werden.

4.2 Gram-Färbetests für bekannte C.-sepedonicum-Kulturen und, wenn möglich, für natürlich infiziertes Gewebe zubereiten (Abschnitt 5.1).

4.3 Bestimmen, welche Proben typische Gram-positive coryneforme Zellen enthalten. lm allgemeinen sind C.-sepedonicum-Zellen 0,8 bis 1,2 pm lang und 0,4 bis 0,6 pm breit.

Ein geeignetes Färbungsverfahren wird in Anlage 3 gegeben.

(1) Ein alternatives Gewinnungsverfahren wird von Dinesen, 1984, angegeben.

(2) Es gibt Anzeichen dafür (Janse und Van Vaerenberg, 1987), daß das Einfrieren die Lebensfähigkeit von Corynebacterium sepedonicum verringert. Mit einer Suspension des Pellets in 10%igem Glyzerin läßt sich dieses Problem lösen.

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Präparate aus natürlich infizierten Kulturen oder erst vor kurzer Zeit isolierten Kulturen weisen häufig ein Vorherrschen kokkenähnlicher Stäbchen auf, die in der Regel ein wenig kleiner sind als die Zeilen von älteren Agarkulturen. Auf den meisten Kulturmedien sind C.-sepedonicum-Zellen vielgestaltige coryneforme Stäbchen, die eine variable Gram-Reaktion zeigen können. Die Zellen erscheinen einzeln, paarweise, mit den für eine winklige Teilung typischen "Ellbogen", und gelegentlich in unregelmäßigen Gruppen und ähneln dann chinesischen Buchstaben.

Schema für den IF-Test

5.1 Antiserum für einen bekannten Stamm von C. sepedonicum verwenden: ATCC 33113 (NCPPB 2137) oder NCPPB 2140. Es sollte einen IF-Titer von mehr als 1:600 haben. Eine PBS-Kontrolle auf dem Testobjektträger einbeziehen, um zu bestimmen, inwieweit sich das Fluorescein-isothiozyanat-Konjugat (FITC) auch nichtspezifisch mit Bakterienzellen verbindet. Corynebacterium sepedonicum (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) sollte als homologe Antigenkontrolle auf einem gesonderten Objektträger verwendet werden. In natürlicher Weise infiziertes Gewebe (das durch Gefriertrocknung oder Einfrieren auf -20°C haltbar gemacht wurde) sollte möglichst als eine gleichartige Probe auf demselben Objektträger verwendet werden (Abbildung 2).

5.2 Verfahren

5.2.1 Drei aufeinanderfolgende Zehnfachverdünnungen (101 , 102, 103) des restlichen Pellets in destilliertem Wasser zubereiten (Abbildung 1).

5.2.2 Pro Feld eines Multi-Objektträgers wie in Abbildung 1 ein bestimmtes, für die Bedeckung des Fensters ausreichendes Standardvolumen (circa 25 pl) jeder Pellet-Verdünnung oder C.- sepedonicum-Suspension (circa 106 Zellen/ml) pipettieren. Abbildung 1

Objektträger für Proben und PBS-Kontrolle

Unverdünnte Probe

Verdünnte Probo

1:10 1:100 1:1000

in doppelter Ausführung

Antiserum mit ausgewählter Verdünnung

Abbildung 2

Positiver Kontrollobjektträger

1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200

Antiserumverdünnung

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5.2.3 Bei etwa 37 °C lufttrocknen lassen und mit 95%igem Äthanol oder durch Abflammen fixieren.

5.2.4 Die entsprechenden Felder mit C.-sepedonicum-Antiserum in den empfohlenen Verdünnungen (0,01 M PBS pH 7,2; Anlage 2), wie in Abbildung 1 gezeigt, bedecken. (PBS auch für die FITC-Kontrolle verwenden.) Die zur Arbeit verwendete Verdünnung des Antiserums sollte etwa halb so groß wie der IF-Titer sein. Sollen andere Antiserum-Verdünnungen einbezogen werden, so sollten gesonderte Objektträger für jede zu verwendende Verdünnnung vorbereitet werden.

5.2.5 Objektträger in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur 30 Minuten lang bebrüten.

5.2.6 Sorgfältig mit 0,01 M PBS pH 7,2 spülen. Dreimal jeweils fünf Minuten lang mit 0,01 M PBS pH 7,2 waschen.

5.2.7 Sorgfältig die überschüssige Flüssigkeit entfernen.

5.2.8 Jedes Feld mit FITC-Konjugat in derselben Verdünnung bedecken, die verwendet wurde, um den Titer zu bestimmen, und in einer dunklen feuchten Kammer bei Raumtemperatur 30 Minuten lang bebrüten.

5.2.9 Spülen und waschen wie oben.

5.2.10 Etwa 5 bis 10 p1 0,1 M phosphatgepuffertes Glycerin ph 7,6 (oder ein ähnliches Einbettungsmittel mit einem ph-Wert von nicht weniger als 7,6) auf jedes Feld applizieren und mit einem Deckglas abdecken (Anlage 2).

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5.2.11 Mit einem Mikroskop prüfen, das mit einer epifluoreszenten Lichtquelle und für die Arbeit mit FITC-geeigneten Filtern ausgerüstet ist. Eine 400- bis 1000-fache Vergrößerung ist angemessen. Jedes Feld in zwei rechtwinklig zueinanderstehenden Durchmessern sowie am Feldrand entlang mikroskopisch untersuchen. Fluoreszierende Zellen in den positiven Kontrollen beobachten und den Titer bestimmten. Fluoreszierende Zellen im FITCIPBS-Kontrollfeld suchen und, wenn keine solchen Zellen zu finden sind, zu den Testfeldern übergehen. In mindestens zehn Mikroskopierfeldern die durchschnittliche Anzahl morphologisch typischer fluoreszierender Zellen je Feld bestimmen und die Anzahl im unverdünnten Pellet (je ml) berechnen (Anlage 4).

Beim Immunfluoreszenz-Test ergeben sich mehrere Probleme:

6.1 Das Pellet im Sinne von Abschnitt 3.3 wird auf mindestens 25 Eierfrüchte im Blattstadium 3 (Anlage 5) verteilt, und zwar nach einer der nachstehenden Methoden (Abschnitte 6.2, 6.3 oder 6.4). Landesgesetzblatt tür Oberösterreich, Jahrgang 1997, 70. Stück, Nr. 125 Ssite 511

6.2 Schlitzinokulation I

6.2.1 Töpfe waagrecht fixieren (Block aus expandiertem Polystrol mit einer ca. 5 cm tiefen, 10 cm breiten und 15 cm langen Aushöhlung aus der Oberfläche (Abbildung 3), reicht für einen 10-cm-Topf aus). Ein Streifen steriler Aluminurnfolie sollte zwischen dem Stez~gel und dem Block für jede getestete Probe plaziert werden. Die Eierfrucht kann durch ein um den Block geschlungenes Gummiband festgehalten werden.

6.2.2 Mit einem Skalpell wird zwischen den Keimblättern und dem ersten Blatt ein 0, 5 bis 1,0 cm langer und etwa drei Viertel des Stengeldurchmessers tiefer Längsschnitt oder leicht diagonaler Schnitt durchgeführt.

6.2.3 Den Schlitz mit der Spitze der Skalpellschneide offenhalten und den Impfstoff mit einem - mit dem Pellet behafteten - feinen Pinsel in den Schlitz hineinstreichen. Den Rest des Pellets auf die Eierfrüchte verteilen.

5.2.4 Schnitt mit steriler Vaseline aus einem 2-ml-Spritzenzylinder versiegeln.

Abbildung 3

6.3 Schlitzinokulation II

6.3.1 Die Eierfrucht zwischen zwei Fingern halten, einen Tropfen (etwa S bis 10 pl) des suspendierten Pellets auf den Stengel zwischen den Keimblättern und dem ersten Blatt pipettieren.

6.3.2 Mit einem sterilen Skalpell von dem Pellettropfen aus diagonal (in einem Winkel von etwa S°) einen 1,0 cm langen und etwa zwei Drittel der Stengeldicke tiefen Schlitz schneiden.

6.3.3 Den Schnitt mit steriler Vaseline aus einem Spritzenzylinder versiegeln.

6.4 Spritzenimpfung

6.4.1 Eierfrüchte einen Tag vor der Impfung nicht wässern, damit der Turgor verringert wird.

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6.4.2 Mit einer Spritze, die mit einer hypodermischen Nadel (nicht weniger als 23 G) versehen ist, die Stengel der Eierfrucht direkt über den Keimblättern beimpfen. Das Pellet auf die Eierfrüchte verteilen.

6.5 25 Eierfrüchte mit einer bekannten C.-sepedonicum-Kultur beimpfen und, soweit möglich, aus natürlich infiziertem Knollengewebe (Abschnitt 5.1) nach derselben Inokulationsmethode (Abschnitt 6.2, 6.3 oder 6.4) beimpfen.

6.6 25 Eierfrüchte mit sterilen 0,05 M PBS nach derselben Impfmethode (Abschnitt 6.2, 5.3 oder 6.4) beimpfen.

6.7 Die Eierfrüchte unter geeigneten Bedingungen (Anlage 5) 40 Tage lang inkubieren. Nach 8 Tagen regelmäßig auf Symptome prüfen. Die Anzahl der Eierfrüchte mit Symptomen zählen. C.sepedonicum verursacht ein Welken der Eierfruchtblätter, das mit einer Schlauheit der Blätter an den Rändern oder zwischen den Blattnerven beginnen kann. Welkes Gewebe kann zunächst dunkelgrün oder gesprenkelt aussehen, wird aber dann, bevor es nekrotisch wird, blasser. Welke Stellen zwischen den Blattnerven haben häufig ein schmieriges, wassergetränktes Aussehen. Nekrotisches Gewebe hat oft einen hellgelben Rand. Die Eierfrüchte sterben nicht unbedingt ab; je länger es dauert, bis die Symptome auftreten, desto größer ist die Überlebenschance. Die Eierfrüchte Können die Infektion überstehen. Anfällige junge Eierfrüchte sind gegenüber niedrigen Populationen vom C. sepedonicum empfindlicher als ältere Eierfrüchte; deshalb sollten Eierfrüchte im oder gerade vor dem Blattstadium 3 verwendet werden.

Das Welken kann auch durch Population anderer Bakterien oder Pilze hervorgerufen werden, die sich in dem Pellet von Knollengewebe befinden. Dazu gehören Erwinia carotovora subsp. carotovora und E. carotovora subsp. atrospetica, Phoma exigua var. foveata sowie große Populationen saprophytischer Bakterien. Eine solche Welke ist von der durch C. sepedonicum verursachten Welke zu unterscheiden, da ganze Blätter oder ganze Pflanzen rasch welken.

6.8 Eine Gram-Färbung (Abschnitt 4) von allen Einheiten aus Eierfrüchten mit Symptomen zubereiten, Teile verwelkten Blattgewebes und Stengelgewebes von Eierfrüchten voneinander isoliert auf entsprechende Nährmedien bringen (Abschnitt 7). Eine Oberflächendesinfektion der Eierfruchtblätter und -stengel durch Abreiben mit 70%igem Äthanol vornehmen.

6.9 Unter bestimmtem Umständen - insbesondere dann, wenn die Wachstumsbedingungen nicht optimal sind - kann es vorkommen, daß C. .sepedonicum als latente Infektion selbst nach einer Bebrütung von 40 Tagen innerhalb der Eierfrüchte weiterbesteht. Derartige Infektionen können bei den geimpften Eierfrüchten möglicherweise zu einer Verkümmerung und zu Wachstumsschwäche führen. Erweist sich der IF-Test als positiv, so kann es erforderlich sein, den Test fortzusetzen. Es ist daher wesentlich, die Wachstumsgeschwindigkeit aller Eierfruchttestpflanzen mit den mit sterilem 0,05 M PBS beimpften Kontrollproben zu vergleichen und die Umweltbedingungen des Treibhauses zu beobachten.

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für die Fortsetzung des Tests wird folgendes empfohlen:

6.9.1 Die Stengel oberhalb der Impfstelle abschneiden und die Blätter entfernen.

6.9.2 Die Stengel - wie in den Abschnitten 3.1 und 3.2 beschrieben - in 0,05 M PBS pH 7,0 mazerieren.

6.9.3 Mit dem halben Pellet eine Gram-Färbung (Abschnitt 4) und einen IF-Test (Abschnitt 5) durchführen.

6.9.4 Mit der anderen Hälfte einen erneuten Eierfruchttest (Abschnitt 6) durchführen, wenn die Gram-Färbung und/oder die IF-Tests positiv sind. Eine bekannte C.-sepedonicum-Kultur und sterile 0,05 M PBS Kontrollen verwenden. Werden in dem anschließenden Test keine Symptome beobachtet, muß die Probe als negativ angesehen werden.

Isolierung von C. sepedonicum

Die Diagnose kann nur bestätigt werden, wenn C. sepedonicum isoliert und damit identifiziert wird (Abschnitt 8). Obwohl C. sepedonicum ein anspruchsvoller Organismus ist, kann es von dem Gewebe, das die betreffenden Symptome aufweist, isoliert werden. Es kann jedoch in seinem Wachstum von rasch wachsenden saprophytischen Bakterien überholt werden; deshalb sind Isolierungen direkt aus dem Pellet aus Knollengewebe (Abschnitt 3,3) nicht zu empfehlen. Eierfrüchte bilden ein ausgezeichnetes selektives Anreicherungsmedium für das Wachstum von C. sepedonicum und liefern auch einen ausgezeichneten bestätigenden Wirtstest.

Isolierungen sollten von allen Kartoffelknollen und Eierfrüchten mit den entsprechenden Symptomen vorgenommen werden (Abschnitte 4 und b). Ist eine Mazeration von Eierfruchtstengeln erforderlich, so sollte sie so ausgeführt werden, wie dies in den Abschnitten 3 und

6.9 beschrieben ist.

7.1 Suspensionen auf eines der folgenden Medien aufstreichen (die Formeln werden in Anlage 6 angegeben):

Dextrose-Nähraltar (nur für Weiterkultur), Hefe-Pepton-Glukose-Agar, Hefe-Dextrose-Nähragar, Hefeextrakt-Mineralsalz-Agar. Bis zu 20 Tagen bei 21 °C bebrüten.

C. .sepedonicum wächst langsam und bildet in der Regel innerhalb von 10 Tagen winzige cremefarbige kuppelförmige Kolonien. Wiederausstreichen, um Reinkultur herzustellen.

Die Wachstumsgeschwindigkeit verbessert sich bei der Weiterkultur. Typische Kolonien sind cremig-weiß oder elfenbeinfarben, abgerundet, glatt, erhöht, konvexgewölbt, schleimig-flüssig, mit ganzen Rändern und einem Durchmesser von in der Regel 1 bis 3 mm.

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Identifizierung

Viele Gram-positive coryneforme Bakterien, deren Kolonien ähnliche Eigenschaften haben wie die von C. sepedonicum, lassen sich aus gesunden oder kranken Kartoffeln und Eierfrüchten isolieren. In diesem Zusammenhang muß C. sepedonicum durch folgende Tests identifiziert werden:

IF-Test (Abschnitt 5.1), Eierfruchttest,

Nähr- und physiologische Tests (Anlage 7): - Oxidatioins-

/Fermentationstest (O/F),

(2) 4

wobei d = Durchmesser des Objektivfeldes.

d entweder durch direktes Messen oder aufgrund der folgenden Formeln

ermitteln:

~i2 s=

G~K2 x 4 l3)

wobei i = Feldkoeffizient (hängt vom Okulartyp ab und variiert

zwischen 8 und 24), K = Tubuskoeffizient (1 oder 1,25),

G = (100fache, 40fache usw.) Vergrößerung des Objektivs. Von (2) d =

nie Von (3) d = 4x G 2K2 x 4 _i

Y GK

Zählen: Anzahl der typischen fluoreszierenden Zellen je Feld (c)

Berechnen: Anzahl der typischen fluoreszierden Zellen je Gesamtfeld

Berechnen: Anzahl der typischen fluoreszierenden Zellen je ml Pellet

(N)

N= Cx 1000 xF

y wobei y = Volumen des Pellets auf dem Objektträgerfeld, F =

Pellet-Verdünnungsfaktor.

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Anlage 5

EIERFRUCHTKULTUR

Eierfruchtsamen (Solanum melongena, Sorte Black Beauty) in pasteurisierte Saaterde säen. Sämlinge mit voll entfalteten Keimblättern (10 bis 14 Tage) in pasteurisierte Topferde umsetzen. Eierfrüchte im Blattstadium 3 verwenden, wenn zwei, aber nicht mehr als drei Blätter vollständig entfaltet sind.

Die Eierfrüchte sollten in einem Treibhaus gezogen werden, das die folgenden Umweltbedingungen aufweist:

Tageslänge: 14 Stunden oder natürliche Tageslänge, wenn größer;

Temperatur: am Tag: 21 bis 24 °C,

in der Nacht: 15 °C.

NB: C. sepedonicum wächst nicht bei Temperaturen oberhalb 30 °C. Wenn die Nachttemperaturen nicht auf 15 °C fallen, kann ein Chromophorschaden (silbrige Necrose) auftreten.

Wurzelschäden, die durch die Larven der Sciaridmücke hervorgerufen werden, lassen sich durch ein geeignetes Insektizid beheben. Die Eierfrucht der Sorte Black Beauty kann unter folgenden Adressen bezogen werden:

Destilliertes Wasser1 l

1/2 Litervolumen des Mediums 20 Minuten lang bei 115 °C durch

Autoklavieren sterilisieren.

Anlage 7

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NÄHRTESTS UND PHYSIOLOGISCHE TESTS ZUR IDENTIFIZIERUNG VON C.

SEPEDONICUM

Alle Medien sollten bei 21 °C inkubiert und nach 6 Tagen geprüft werden. Ist kein Wachstum erfolgt, bis zu 20 Tagen inkubieren.

Destilliertes Wasser1 I

Mischen und auf pH 7,0 bis 7,2 einstellen, mit 1 N KOH. In Pyrex-Kulturröhrchen (16 mm x 100 mm, Kapazität 12 ml) in Volumen von 5 ml und 10 ml verteilen.

Zehn Minuten lang bei 115°C durch Autoklavieren sterilisieren. Stichbeimpfung in 5-ml- und 10-ml-Zylindern für jede Kultur. Aseptisch 1 bis 2 ml steriles flüssiges Paraffin in den 10-ml-Zylinder hinzugeben. Bebrüten.

Positive Reaktion:

ZylinderFarbeDeutung

offengelbGärung bewirkend

geschlossengelb

offengelbOxidation bewirkend

geschlossenblaugrün

offengrünlich ~Oxidation bewirkend

geschlossenblaugrünoder inert

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Qxidasetest (Kovacs, 1956)

Kovacs'Oxidase-Reagens:

1%ige wäßrige Lösung von Tetramethyl-Paraphenylendiamin-Dihydrochlorid (BDH Nummer 30386) in destilliertem Wasser. Dieses Reagens sollte frisch in einer Menge von 1 ml zubereitet werden oder kann 1 bis 4 Wochen lang bei 5 °C in einer braunen Glasflasche aufbewahrt werden.

Einen Tropfen des Reagens in einer sauberen Petrischale auf Filterpapier geben. Sofort mit Hilfe einer Platinöse ein wenig von der Testkultur aus dem Nähraltar verreiben.

Positive Reaktion: Entwicklung einer Purpurfärbung innerhalb von zehn Sekunden. Kulturen, bei denen die Färbung 10 bis 30 Sekunden braucht, sind schwach positiv.

NB: Es ist wichtig, daß eine Platinöse und NA-Kulturen verwendet werden, da Spuren von Eisen oder ein hoher Zuckergehalt im Wachstumsmedium falsche positive Ergebnisse zur Folge haben können.

4.1 In den gemäß § 5 Z.1 für kontaminiert erklärten Erzeugungsorten:

4.2. Innerhalb der abgegrenzten Sicherheitszone muß die Behörde unbeschadet der Maßnahmen gemäß Z. 4.1